Fanlab

Химия · Органическая химия · 3 курс

Аминокислоты и белки

Почему при добавлении кислоты в молоко казеин свёртывается и получается катык?

Открыть эксперимент

Ситуация

В лаборатории Ташкентского молочного комбината проверяют утреннее молоко. Если капнуть в молоко немного уксусной кислоты, оно сразу свернётся: белые хлопья — казеин — отделятся от желтоватой сыворотки; а если сварить яичный белок, прозрачная жидкость побелеет и затвердеет. Как белки построены из аминокислот, почему они осаждаются при определённом pH и что в них нарушается при нагревании?

Тема

Аминокислоты, пептиды и белки. Ташкентский молочный комбинат: при добавлении кислоты в молоко казеин свёртывается и превращается в кефир и сыр; яичный белок при нагревании белеет. В лаборатории аминокислота…

Ключевые понятия

  • Изоэлектрическая точка
  • Пептидная связь
  • α-спираль и β-слой

Формулы

pI=12(pKa1+pKa2)

Изоэлектрическая точка — pH, при котором суммарный заряд равен нулю: середина между значениями pKₐ по обе стороны от цвиттер-иона.

pH=pKa+lg⁡[A−][HA]

Хендерсон–Хассельбальх: в точке полуэквивалентности pH = pKₐ.

C3H7NO2+C2H5NO2→C5H10N2O3+H2O

Аланин + глицин → дипептид Ala-Gly + вода (образование пептидной связи; на практике — через защиту и активацию).

n=3,6 остатка/виток,p=0,54 нм

α-спираль (Полинг–Кори, 1951): 3,6 остатка на виток, шаг 0,54 нм, 0,15 нм на остаток; водородная связь C=O(i)···H–N(i + 4).

v=μE,μ∝zr

Электрофорез: скорость пропорциональна напряжённости поля и заряду частицы; при pI z = 0 — частица не движется.

Теория

Биоорганическая химия, клетка и аминокислоты

Биоорганическая химия изучает строение и функции веществ живой природы — белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и биорегуляторов. В элементарном составе клетки ≈ 98 % приходится на четыре элемента — O, C, H, N (остальное — P, S, K, Na, Ca, Mg, Fe и микроэлементы); в молекулярном составе основную часть составляет вода, а в сухом веществе преобладают белки. У прокариотических клеток (бактерий) нет ядерной оболочки, у эукариот ДНК находится в ядре, а органоиды отделены мембранами. Мембрана — липидный бислой с погружёнными в него белками (жидкостно-мозаичная модель Сингера–Николсона, 1972): барьер, транспорт, приём сигналов. В Узбекистане школа биоорганической химии связана с именем академика О. С. Садыкова — Институт биоорганической химии в Ташкенте носит его имя. Гетерофункциональные соединения: гидроксикислоты (молочная, яблочная, лимонная), оксокислоты (пировиноградная, ацетоуксусная) и аминокислоты; реакция Реформатского — α-бромэфир с цинком и альдегидом (кетоном) даёт β-гидроксиэфир. 20 α-аминокислот белков по боковой цепи делятся на неполярные (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met), ароматические (Phe, Tyr, Trp), полярные (Ser, Thr, Cys, Asn, Gln), отрицательно (Asp, Glu) и положительно заряженные (Lys, Arg, His); Trp, His, Pro — гетероциклические. Незаменимые для взрослых аминокислоты (не синтезируются в организме, должны поступать с пищей): Val, Leu, Ile, Thr, Met, Phe, Trp, Lys (и His); остальные — заменимые. В воде аминокислота существует как цвиттер-ион H₃N⁺–CHR–COO⁻: в кислоте — катион, в щёлочи — анион; pH, при котором суммарный заряд равен нулю, — изоэлектрическая точка pI. В медицине смеси аминокислот используют для внутривенного питания, а некоторые — как лекарства.

Химические свойства и стереохимия

Все белковые аминокислоты, кроме глицина, хиральны; в белках встречается только L-ряд (в проекции Фишера NH₂ слева; сравнивается с глицериновым альдегидом). Большинство имеет (S)-конфигурацию, а цистеин — (R): из-за серы меняется старшинство по правилам CIP, пространственное расположение то же. L-аминокислоты можно узнать по правилу «CORN». Разделение энантиомеров: диастереомерные соли, ферменты (ацилаза гидролизует только L-форму), хиральная хроматография. Реакции: карбоксил — сложные эфиры (спирт + HCl), аминогруппа — N-ацильные производные, основания Шиффа (с альдегидами; так работают ферменты с пиридоксальфосфатом), с 2,4-динитрофторбензолом — жёлтое ДНФ-производное (Сенгер), с фенилизотиоцианатом — фенилтиогидантоин (Эдман), с нингидрином — сине-фиолетовое окрашивание (фиолетовый Руэмана; пролин — жёлтое). В составе белка аминокислоты модифицируются: гидроксипролин (коллаген), фосфосерин (казеин), цистин (S–S-мостик), гликозилированный аспарагин.

Пептидная связь и синтез пептидов

Пептидная связь –CO–NH– образуется при отщеплении воды от карбоксила одной аминокислоты и аминогруппы другой. Из-за резонанса связь C–N частично двойная: длина ≈ 0,133 нм (у обычной C–N 0,147 нм, у C=N 0,128 нм), вращения вокруг неё нет, шесть атомов Cα–C(O)–N(H)–Cα лежат в одной плоскости, обычно в транс-положении (ω = 180°). Цепь вращается только вокруг Cα: углы φ и ψ. Полипептидная теория строения белка (Э. Фишер, Ф. Гофмейстер, 1902): белок — цепь аминокислот, соединённых пептидными связями. При химическом синтезе две аминокислоты нельзя просто смешать — у каждой есть и аминогруппа, и кислотная группа, в результате получится смесь. Поэтому ставят защитные группы: на аминогруппу — Boc, Z (бензилоксикарбонил), Fmoc; на карбоксил — метиловый, бензиловый эфиры. Карбоксил активируют: хлорангидрид (SOCl₂), азид (Курциус), смешанный ангидрид, активированные эфиры (п-нитрофениловый, N-гидроксисукцинимидный), карбодиимид (ДЦК — дициклогексилкарбодиимид: образуется О-ацилизомочевина, побочный продукт — нерастворимая дициклогексилмочевина). Затем защиту снимают (Boc — трифторуксусной кислотой, эфир — щелочным гидролизом). Р. Меррифилд (1963) изобрёл сборку цепи на полимерных гранулах в твёрдой фазе (Нобелевская премия, 1984).

Структура белка и денатурация

Простые белки (протеины) состоят только из аминокислот, сложные (протеиды) — с дополнительной группой: гликопротеины, липопротеины, нуклеопротеины, металлопротеины, фосфопротеины (казеин молока). Первичная структура — последовательность: Ф. Сенгер в 1955 году первым определил последовательность инсулина — 51 остаток (цепь A — 21, цепь B — 30), 3 дисульфидных мостика (A6–A11, A7–B7, A20–B19). Вторичная: α-спираль (Полинг и Кори, 1951) — правая спираль, 3,6 остатка на виток, шаг 0,54 нм, водородные связи C=O(i)···H–N(i + 4) вдоль оси; β-слой — вытянутые цепи рядом, водородные связи между цепями (параллельные или антипараллельные), β-изгибы. Третичная — пространственная укладка цепи: гидрофобное ядро, водородные связи, ионные пары, S–S-мостики. Четвертичная — несколько цепей (гемоглобин α₂β₂; инсулин сохраняется в виде гексамера с ионами Zn²⁺). Денатурация — при нагревании, действии кислоты или щёлочи, тяжёлых металлов, спирта, мочевины нарушаются вторичная–четвертичная структуры, а пептидные связи сохраняются; яичный белок необратимо свёртывается примерно при 60–80 °C. Определение N- и C-концов: Сенгер (ДНФБ → ДНФ-аминокислота), Эдман (ФИТЦ → ФТГ-аминокислота, цепь укорачивается на один остаток, и цикл повторяется), дансилхлорид (флуоресцентный), Акабори (гидразинолиз → C-конец); ферментативно — аминопептидаза (N-конец), карбоксипептидаза (C-конец).

Ферменты и пептидные биорегуляторы

Ферменты — катализаторы белковой природы: в отличие от неорганических катализаторов они очень избирательны и работают в мягких условиях (37 °C, pH ≈ 7). Активный центр: часть, связывающая субстрат, и каталитическая часть (например, имидазол гистидина — переносчик H⁺); к аллостерическому центру присоединяется эффектор и изменяет активность. Многим ферментам нужен кофактор (Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺) или кофермент (NAD⁺, FAD, пиридоксальфосфат, кофермент A). Изоферменты — формы, ускоряющие одну реакцию, но различающиеся по строению (лактатдегидрогеназа — пять). Полиферментные системы выполняют цепи метаболизма (пируватдегидрогеназный комплекс). Кинетика ферментов — в эксперименте «Катализ и ферменты». Пептидные гормоны: инсулин и глюкагон (поджелудочная железа), соматотропин и пролактин (гипофиз), паратгормон и кальцитонин (обмен Ca²⁺), ангиотензин (давление), брадикинин, гастрин, секретин. Нейропептиды: энкефалины, эндорфины, окситоцин, вазопрессин. Токсины: грибов (α-аманитин), пчёл (мелиттин), змей (α-бунгаротоксин), скорпионов (хлоротоксин). Пептидные антибиотики: грамицидин S, полимиксин, актиномицин D. Всё это — в «Галерее».

Выделение, лабораторные работы и о модели

Выделение белков: гомогенизация, экстракция, высаливание (сульфат аммония: глобулины осаждаются при половинном насыщении, альбумины — при полном), диализ, хроматография (адсорбционная, распределительная, ионообменная, аффинная, ВЭЖХ — «Экстракция и хроматография»), электрофорез (белки сыворотки при pH 8,6 разделяются на фракции альбумина, α₁, α₂, β, γ), масс-спектрометрия. Белки — амфотерные полиэлектролиты (полиамфолиты): ниже pI заряжены положительно, выше — отрицательно; в точке pI цепь сворачивается наиболее плотно, растворимость, вязкость и набухание минимальны — казеин осаждается при pH ≈ 4,6 (Л5). Гидродинамика полиэлектролитов, изоэлектрическая точка желатина и равновесие Доннана — в эксперименте «Физика макромолекул». Лаборатория: Л1 — цветные реакции (нингидриновая, биуретовая, ксантопротеиновая, Миллона, Фоля), Л2 — растворимость и осаждение (нагревание, соли тяжёлых металлов, спирт, кислота, соль), Л3 — альбумин и глобулины из яичного белка, Л4 — белки яичного белка и сыворотки крови, кислотный гидролиз (6 M HCl, 110 °C) и аминокислотный состав, Л5 — казеин из молока. Безопасность: с концентрированными HNO₃ и NaOH — очки и перчатки; реактив Миллона содержит ртуть — он ядовит; соли тяжёлых металлов не выливайте в канализацию; нингидрин оставляет на коже пятна. Модель: значения pKₐ — табличные при 25 °C, группы независимы; титрование считается точно из баланса зарядов; в электрофорезе скорость пропорциональна заряду (размер не учтён); кривая буферного действия молока и кривые осаждения — приблизительные; след Cα инсулина — схема, рассчитанная по ограничениям, а не координаты кристалла; модели галереи — схематичные «бусы».

Знаете ли вы?

  • Фредерик Сенгер получил Нобелевскую премию в 1958 году за определение аминокислотной последовательности инсулина, а в 1980 году — за метод чтения последовательности ДНК: он первый учёный, дважды удостоенный Нобелевской премии по химии (второй — Барри Шарплесс, 2001 и 2022).
  • Лайнус Полинг и Роберт Кори предложили модели α-спирали и β-слоя в 1951 году — раньше первых точных структур кристаллов белков, опираясь на плоскостность пептидной связи и водородные связи.

Что внутри эксперимента

Эксперимент начинается с жизненной ситуации: вы предсказываете результат, меняете параметры, проводите опыт и делаете вывод. Внутри — задания, теория, тест и экскурсия: камера сама движется и объясняет главное.

Другие эксперименты раздела