Химия · Органическая химия · 3 курс

Гетероциклы и ДНК

Почему пиридин — основание, а пиррол почти нет, и чем удерживается двойная спираль ДНК?

Ситуация

В Институте химии растительных веществ в Ташкенте из растений выделяют алкалоиды: почти все они — азотистые гетероциклы. А в соседней лаборатории геномики из семян хлопчатника выделяют ДНК и нагревают в спектрофотометре — поглощение при 260 нм вдруг резко растёт. Почему пиридиновое кольцо — основание, а пиррол почти не основание? Чем удерживаются две цепи ДНК и почему при нагревании они «плавятся»?

Тема

Гетероциклы и нуклеиновые кислоты. Институт химии растительных веществ АН РУз (школа алкалоидов академика С. Ю. Юнусова) и Центр геномики: выделение ДНК из хлопковых семян, кристаллы алкалоидов,…

Ключевые понятия

Ароматичность (4n + 2)
Пары Уотсона–Крика
Плавление ДНК и Tₘ

Формулы

N_{π} = 4 n + 2

Правило Хюккеля: плоский непрерывно сопряжённый цикл с $4 n + 2$ π-электронами (n = 0, 1, 2 …) ароматичен.

L_{r}^{+} = E_{π} (цикл) - E_{π} (σ -комплекс)

Энергия локализации при электрофильной атаке (в единицах $| β |$ ): чем меньше L, тем выгоднее положение.

\frac{A + G}{T + C} = 1, A = T, G = C

Правило Чаргаффа (двухцепочечная ДНК): число пуринов равно числу пиримидинов.

T_{m} = 69,3 + 0,41 \cdot (% G C)^{\circ} C

Мармур–Доти: температура плавления длинной ДНК в растворе 1×SSC зависит от доли GC-пар.

A = ε c l; A_{260} = 1 \Leftrightarrow 50 мкг/мл ДНК

Бугер–Ламберт–Бер: для двухцепочечной ДНК $A_{260} = 1$ соответствует ≈ 50 мкг/мл, для РНК ≈ 40 мкг/мл.

Теория

Гетероциклы: ароматичность и номенклатура

Гетероцикл — соединение, в цикле которого вместе с углеродом есть гетероатом, например N, O, S. Пятичленные пиррол, фуран, тиофен и шестичленный пиридин — как и бензол, плоские непрерывно сопряжённые циклы; в них 6 π-электронов ( $4 n + 2$ , $n = 1$ ), значит, они ароматичны. Различие — во вкладе гетероатома: =N– в пиридине отдаёт один электрон, а его неподелённая пара остаётся в плоскости цикла; –NH– в пирроле, –O– в фуране и –S– в тиофене отдают пару в π-секстет. Поэтому пятичленные циклы π-избыточны (π-плотность на углеродах > 1), а пиридин π-дефицитен (в положениях 2 и 4 < 1). Мера ароматичности — энергия резонанса (Джоуль–Миллс): бензол ≈ 150, тиофен ≈ 122, пиридин ≈ 117, пиррол ≈ 90, фуран ≈ 67 кДж/моль. Номенклатура Ганча–Видмана: префикс гетероатома (окса-, тиа-, аза-; если их несколько — в порядке O > S > N, с цифрами) + корень, показывающий размер цикла и насыщенность (насыщенный / ненасыщенный): 3-членные -иран / -ирен, 4 — -етан / -ет, 5 — -олан / -ол, 6 — -ан / -ин; для азотистых циклов насыщенные -идин (азиридин, азетидин, азолидин), для 6-членных -инан (азинан), ненасыщенный 3-членный -ирин. Многие циклы сохранили тривиальные названия: пиррол, фуран, тиофен, пиридин, имидазол, пиримидин, пурин.

Основность, реакции и стратегии синтеза

Основность зависит от положения неподелённой пары: пиридин присоединяет H⁺ на пару в плоскости, ароматичность сохраняется — p $K_{a H}$ = 5,2; имидазол — 7,0; пиримидин — 1,3. В пирроле пара входит в π-секстет: протон присоединяется только к C2, и ароматичность теряется — p $K_{a H}$ ≈ −3,8, то есть пиррол почти не основание (напротив, N–H — слабая кислота). Электрофильное замещение (SEAr) идёт через σ-комплекс (интермедиат Уэланда); какое положение выгоднее, определяет устойчивость интермедиата — энергия локализации $L^{+}$ , а не плотность в основном состоянии (в пирроле плотность на C3 немного больше, но атака идёт на C2). Пиррол, фуран, тиофен реагируют быстрее бензола, в основном в положение 2; в пиридине SEAr очень затруднено (в кислоте N протонируется), а нуклеофилы атакуют легко (Чичибабин: NaNH₂ → 2-аминопиридин). Стратегии синтеза показывают, из каких фрагментов собирается цикл: «4 + 1» (Пааль–Кнорр: 1,4-дикетон + NH₃ → пиррол, + P₄S₁₀ → тиофен; с кислотой же собственный кислород дикетона замыкает цикл с образованием фурана), «3 + 2» (1,3-дикетон + гидразин → пиразол; синтез Кнорра), «5 + 1» (1,5-дикарбонил + NH₃ → пиридин), «3 + 3» (малоновый эфир + мочевина → барбитуровая кислота — пиримидиновый цикл).

Природные гетероциклы: алкалоиды, основания, нуклеотиды, коферменты

Алкалоиды — азотистые основания растений: никотин (пиридин + пирролидин), анабазин (Anabasis aphylla — растение Средней Азии), гармин (гармала — Peganum harmala), кофеин (пурин). Академик С. Ю. Юнусов (1909–1995) в 1956 году основал в Ташкенте Институт химии растительных веществ; его школа выделила из растений Средней Азии множество новых алкалоидов и установила их строение. Основания нуклеиновых кислот: пурины — аденин (A), гуанин (G); пиримидины — цитозин (C), тимин (T, только в ДНК), урацил (U, в РНК). Основания могут находиться в таутомерных формах: лактам ⇌ лактим (кето ⇌ енол), амино ⇌ имино; в ДНК резко преобладают кето- и аминоформы, редкий таутомер может образовать неправильную пару и привести к точечной мутации. Нуклеозид = основание + пентоза (рибоза или 2-дезоксирибоза), соединённые β-N-гликозидной связью (в пурине через N9, в пиримидине через N1); нуклеотид = фосфатный эфир нуклеозида (5′-АМФ, АТФ); в циклическом нуклеотиде цАМФ фосфат замыкает цикл на 3′- и 5′-O — вторичный посредник гормонального сигнала. Коферменты: НАД⁺ и НАДФ⁺ (никотинамидное кольцо принимает H⁻ в положении C4 и превращается в НАД(Ф)Н), ФАД (изоаллоксазин присоединяет 2H на N1 и N5). Нуклеотиды соединяются 3′,5′-фосфодиэфирными связями в олиго- (до нескольких десятков) и полинуклеотиды.

Строение ДНК и РНК

Первичная структура — последовательность оснований, записывается в направлении 5′→3′. Вторичная — двойная спираль Уотсона–Крика (1953): две антипараллельные цепи, внутри пары A·T (2 водородные связи) и G·C (3), снаружи сахарофосфатный «остов». Правило Чаргаффа: A = T, G = C, (A + G) = (T + C). B-форма (основная в водном растворе): правая спираль, ≈ 10,5 пары на виток, шаг 0,34 нм, высота витка ≈ 3,4–3,6 нм, диаметр ≈ 2 нм, большая и малая бороздки. A-форма (при обезвоживании, двойные спирали РНК и гибриды ДНК–РНК): 11 пар на виток, пары смещены от оси и наклонены, диаметр ≈ 2,3 нм. C-форма — близка к B, при малой влажности: ≈ 9,3 пары на виток. Z-форма — левая спираль, 12 пар на виток, при чередующихся GC-последовательностях (Рич, 1979). Третичная структура: кольцевая и замкнутая ДНК суперспирализуется; у эукариот ДНК наматывается на октамер гистонов 1,65 витка (147 пар), образуя нуклеосому, нуклеосомы собираются в хроматиновую фибриллу, затем в хромосому. Виды РНК: мРНК (копия последовательности белка), тРНК (≈ 76 нуклеотидов, вторичная структура «клеверный лист» и L-образная третичная), рРНК (основа рибосомы). Наследственные болезни — изменения в ДНК: например, при серповидноклеточной анемии в 6-м кодоне гена β-глобина GAG → GTG, и в белке вместо глутамата стоит валин.

Лаборатория: выделение, гидролиз и кривая плавления

Выделение ДНК из семян (Л12): измельчение → лизирующий буфер (детергент, NaCl, ЭДТА, 60 °C) → удаление белков хлороформом и центрифугирование → холодный этанол над водной фазой: ДНК выделяется в виде белой нити и наматывается на палочку. РНК из проросшего маша (Л11) — экстракция кислым фенолом, осаждение этанолом; РНКазы активны, всё делают на льду. Гидролиз (Л13): в щёлочи РНК быстро расщепляется при участии 2′-OH, ДНК устойчива; в кислоте высвобождаются пурины. Качественные реакции: дифениламин (Дише) — дезоксирибоза, синий; орцин (Биаль) — рибоза, зелёный; молибдат аммония — фосфат, жёлтый осадок; AgNO₃ + NH₃ — осадок пуринов. Чистота: A₂₆₀/A₂₈₀ ≈ 1,8 (ДНК), ≈ 2,0 (РНК); примесь белка снижает отношение. Плавление: при нагревании разрушаются водородные связи и стекинг, цепи расходятся, поглощение при 260 нм растёт ≈ на 40 % (гиперхромный эффект). Середина кривой — $T_{m}$ . G·C-пара устойчивее из-за трёх водородных связей и более сильного стекинга: $T_{m} = 69,3 + 0,41 \cdot % G C$ (1×SSC). При уменьшении концентрации соли $T_{m}$ снижается (усиливается отталкивание фосфатов): при уменьшении Na⁺ в 10 раз — ≈ на 16,6 °C; поэтому ДНК с высоким GC (M. luteus, 73 %: в 1×SSC ≈ 99 °C) измеряют в 0,1×SSC. О методе спектрофотометрии — в эксперименте «Оптические методы анализа». Безопасность: фенол и хлороформ ядовиты — перчатки, очки, вытяжной шкаф; этанол держите вдали от огня; если щёлочь или кислота попали в глаза — промойте большим количеством воды.

О модели

π-плотности циклов и энергии локализации рассчитаны по простой модели Хюккеля (параметры Стрейтвизера; параметры для S тиофена — модельные значения); она верно передаёт тенденции, но не точные энергии. 3D-модели молекул собраны из типичных длин связей и углов (не квантово-химическая оптимизация). ДНК: основания — стандартные координаты 3DNA; сахарофосфатная цепь подогнана по идеальным связям и спиральным параметрам A/B-форм (Z-форма — упрощённая однородная левая спираль, настоящий зигзагообразный повтор динуклеотида не показан). Хроматин — схема. Кривая плавления — двухсостоянная модель (ширина ≈ 5 °C), $T_{m}$ из формулы Мармура–Доти; доля GC в образце «семена хлопчатника» — учебный образец (каждый раз другой), а не реальное значение генома.

Знаете ли вы?

Модель двойной спирали Уотсон и Крик опубликовали 25 апреля 1953 года в журнале Nature; рентгенограмма («Снимок 51»), полученная Розалинд Франклин и Реймондом Гослингом, стала важным доказательством спирального строения.
Если вытянуть в одну линию ДНК одной клетки человека (≈ 6,4 миллиарда пар), её длина составит около 2 м — она помещается в ядре диаметром в несколько микрометров с помощью нуклеосом и хроматиновых фибрилл.

Что внутри эксперимента

Эксперимент начинается с жизненной ситуации: вы предсказываете результат, меняете параметры, проводите опыт и делаете вывод. Внутри — задания, теория, тест и экскурсия: камера сама движется и объясняет главное.

Другие эксперименты раздела

Стереохимия и конформации — 2 курс
Радикальный и электрофильный механизмы — 3 курс
SN1, SN2 и элиминирование — 3 курс
Ароматическое кольцо и азокрасители — 3 курс
Карбонильные соединения и синтез — 3 курс
Аминокислоты и белки — 3 курс
Физика макромолекул — 3 курс
Синтез и кинетика полимеров — 3 курс
Химия полимерных материалов — 3 курс